有了这一篇,再也不用问别人,WB蛋白样品制备常见问题大全!
栏目:技术    日期:2020-06-17    来源:admin
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一直都在做蛋白研究,但是样品制备中的小细节你都了解吗?这里为大家整理了蛋白样品制备中大大小小的常见问题,一起来学习吧!


Q

贴壁细胞收集是刮下来好还是胰酶消化好?
A

两种方式都是可行的,各有利弊。不必担心刮刀收集会刮坏细胞,胰酶消化的程度掌握不好,也会让细胞破损。胰酶消化可能会对某些膜蛋白产生影响,刮刀收集效率会略低,可根据自己的实验来选择细胞收集的方式。做总蛋白提取时,可选择直接在器皿中进行裂解,无需提前收集。

PS:使用刮刀收集时,可加入PBS帮助收取细胞。


Q

所有WB实验都用总蛋白就可以完成吗?
A

当然不是,要根据WB的实验目的来确定提取哪类蛋白,如需验证某些低丰度蛋白,或蛋白定位,或组分间表达量对比,则需要进行亚细胞结构分离或组分分离。(点这里具体学习如何确定自己该提取哪类蛋白


Q

提蛋白时要不要加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂?
A

蛋白样品如果长期保存,或者下游实验过程较长,建议加入蛋白酶抑制剂。做磷酸化研究,一定要加入磷酸酶抑制剂!


Q

如需添加蛋白酶抑制剂该如何添加?
A

内源性蛋白酶存在于胞浆中,所以要在细胞裂解前加入抑制剂到达最佳抑制效果,提取时将抑制剂添加到裂解液中,工作浓度1X。例如100X蛋白酶抑制剂,1ml裂解液中添加10ul即可。(蛋白酶抑制剂怎么选点这里


Q

用RIPA提取总蛋白为什么会有粘稠的不可溶沉淀?是什么?如何解决?
A

产生粘稠物的主要原因是RIPA不能将所有样品全部裂解,产生的不可溶组分中主要含有核酸残团,细胞碎片(有些组织样品还含有油脂),和部分蛋白,因此RIPA提取的仅仅是可溶性蛋白,并非真正的总蛋白。

解决方案:使用柱式法蛋白提取真正意义上的总蛋白(详细了解柱式法总蛋白提取。


Q

不同时间点处理细胞,如何收集进行蛋白提取更合理?
A

最好是收集完细胞后马上进行蛋白提取。(推荐阅读:10分钟,15分钟,30分钟收一次细胞,我该什么时候提蛋白?


Q

浓度测定哪家强?
A

浓度测定方法很多,目前推荐使用兼容性较好的BCA法进行浓度测定。(点这里详细学习BCA怎么做,内含用Excel计算浓度步骤


Q

蛋白样品如何储存?
A

蛋白样品不建议久存,也不要反复冻融。下游做WB实验,建议蛋白浓度测定后,加入loading buffer煮样,煮后根据实验需要分装成小管在-80℃,下次使用前拿出小管再次煮样即可。(详细学习蛋白储存方法


Q

样品上样前怎么处理?
A

蛋白浓度测定后,建议将各个样品稀释到某一固定浓度(稀释可以PBS,水或裂解液),加入loading buffer后,在沸水中煮3-5分钟,使蛋白充分变性,也可使用PCR仪95度加热5分钟。(点这里了解为什么加loading buffer

PS:煮沸并非必须步骤,膜蛋白建议70℃或者更低温度煮。

煮后在冰上静置少许时间,进行低速离心,即可上样。


Q

组织样品含血量多可以直接提蛋白吗?
A

如组织样品中含血较多,血红蛋白可能会影响下游实验, 可以在组织样品裂解前使用红细胞裂解液(Invent cat# WA-007)进行处理后,再进行蛋白提取。


针对于蛋白样品制备,你还有哪些疑虑和问题呢?欢迎给我们给我们在下方留言,我们将在下方留言区随机抽取5位送实验室神兽“马上有条带”给你膜拜哦!当然也欢迎与我们的技术老师进一步交流关于蛋白研究的各类问题,点击下方二维码与我们联系!





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