IP（免疫沉淀，Immunoprecipitation）和 Co-IP（免疫共沉淀，Co-immunoprecipitation）都是利用抗体-抗原特异性结合的原理，从复杂样品中富集目标蛋白（IP）或验证蛋白-蛋白相互作用（Co-IP）。两者的核心机制相同，但实验目的有所区别。

• 目的：从细胞裂解液中富集纯化目标蛋白（如检测表达量、翻译后修饰、活性）。

• 原理：

1. 抗体特异性结合目标X蛋白（抗原）。

2. 通过Protein A/G beads（琼脂糖或磁珠）固定抗体-抗原复合物。

3. 离心/磁力架分离复合物，洗去非特异结合蛋白。

4. 洗脱后，通过Western blot或其他方法检测目标蛋白。

示意图：

目标X蛋白（抗原） +抗X抗体 + Protein A/G beads → 形成复合物 → 洗涤 → 洗脱 → 检测X蛋白

• 目的：验证蛋白-蛋白相互作用（如X蛋白是否与Y蛋白结合）。

• 原理：

1. 用抗X蛋白抗体捕获X蛋白（“诱饵”）。

2. 若Y蛋白与X蛋白在体内结合，则Y蛋白会共沉淀下来（“猎物”）。

3. 通过Western blot检测Y蛋白，证明两者互作。

关键点：

• 依赖生理条件下的天然相互作用（非变性条件）。

• 无法直接证明“直接结合”，可能有第三方蛋白搭桥（需进一步验证，如Pull-down）。

示意图：

X-Y复合物 + 抗X抗体 + Protein A/G beads→ 复合物被沉淀 → 洗涤 → 洗脱→检测X蛋白（IP）和Y蛋白（Co-IP）

步骤1：样品制备

收集细胞或取组织样品用预冷PBS洗2次。

选择合适的裂解液配方和提取方法，提取天然有活性的总蛋白样品（裂解物）。留取少量裂解物以备Western blot分析（Input对照）。

步骤2：预清除（可选）

在裂解物中加入IgG或空白微珠，4°C旋转孵育1小时。

4°C离心10分钟去除非特异结合蛋白，以减少背景，将上清转入新的离心管中进行后续实验。

步骤3：免疫沉淀

在裂解物中加入特异性抗体（1–5 μg），4°C孵育过夜。

加入预处理的Protein A/G微珠（30–50 μL），继续孵育2–4小时。

步骤4：洗涤

4°C离心（1000–3000 X g，5分钟）将protein A/G-beads离心至管底，弃上清。用洗涤缓冲液（如TBST）洗涤protein A/G-beads 3–4次，每次4℃旋转5分钟，彻底去除非特异结合。清洗后尽量去除残留液体。

步骤5：洗脱

方法A（变性洗脱）：加入2×SDS上样缓冲液，95°C煮沸5分钟，离心取上清。

方法B（非变性洗脱）：0.2 M 甘氨酸（pH 2.6）洗脱10分钟，立即用Tris-HCl（pH 8.5）中和

步骤6：SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析

Western Blot检测

必须包括：Input（阳性对照）、IgG同型对照（阴性对照）、空载/敲除/敲低对照（验证特异性）。可选对照：仅含微珠对照

1. Input（阳性对照）

定义：实验开始时，未经过IP步骤、直接保存的细胞裂解液样本（通常取总量的5%-10%）。

作用：

*验证目标蛋白是否表达：确认细胞中确实存在Protein X和Protein Y。

*标准化信号强度：用于计算IP效率（如“Protein X在IP样本中的富集倍数”）。

*排除假阴性：若Input中无信号，可能是抗体或细胞裂解问题。若Input中看到目的蛋白信号，但在IP样品中没检测到，则表明抗体正常工作，IP富集失败。

Input是IP实验结果解读的重要标准，每次实验务必准备Input样本对照。

2. IgG同型对照（阴性对照）

定义：使用与一抗相同种属、相同亚型的非免疫抗体（如正常小鼠IgG）进行的平行IP实验。

作用：

*排除非特异性结合：若IgG组检测到Protein Y（或珠子背景信号），说明互作可能是假阳性。

*评估抗体特异性：确保目标蛋白的富集是依赖特异性抗体，而非Fc段或珠子非特异吸附。

3. 仅含微珠对照（可选的额外阴性对照）
 定义：在Co-IP实验中，仅用Protein A/G微珠（不加任何抗体）孵育细胞裂解液的阴性对照组。

作用：

*排除微珠非特异吸附：检测是否有蛋白（如Protein X或Protein Y）直接吸附在微珠表面（无抗体介导）。若此组检测到信号，说明微珠本身导致假阳性，需优化洗涤条件或更换微珠。

*验证抗体依赖性：结合IgG同型对照，可区分“微珠背景”与“抗体非特异结合”。

实验方案-对照设置

 表1.对照设置

若IgG组出现Protein Y信号，需优化洗涤条件或更换抗体。