低分子量蛋白WB太难做，两招解决！
栏目：技术    日期：2022-02-17    来源：admin

常规SDS-PAGE和免疫印迹技术（WB）是研究30~250kDa（分子量）蛋白质的有力工具，但对于一些<20kDa的低分子量蛋白检测，使用WB可能会遇到一定的困难：区分度差、信号弱或检测不到目标蛋白。

低分子量蛋白WB难做主要有两个原因：

（1）低分子量蛋白大多为疏水性蛋白[1]，疏水性蛋白能够在亲水-疏水界面形成一层紧密稳定的两性膜，所以低分子量蛋白在样品制备过程中更不容易被提取；

（2）在传统的Tris-Glycine缓冲体系中，低分子量蛋白与SDS形成的复合物具有与SDS本身类似的电荷和大小，导致蛋白相对迁移率和分子质量对数的直线关系发生偏离、SDS离子与低分子量蛋白混合无法分离，致使条带模糊、条带无法区分，此外还干扰低分子量蛋白的固定和染色。


所以为了提高低分子量蛋白在WB中的检出率，我们一方面需要提高样品质量以减少低分子量蛋白的损失，另一方面还需对常规的SDS-PAGE和WB的实验条件进行一定的优化。



01
提高蛋白样品质量

使用RIPA裂解组织或细胞通常会产生可溶性组分和不可溶性组分，而不可溶性组分中含有的低分子量蛋白则被丢弃，导致实验结果不佳；

推荐使用Invent柱式法蛋白提取技术——优化的裂解液可有效裂解组织或细胞，无不可溶性组分产生，高效提取蛋白质包括难溶性蛋白，解决低分子量蛋白丢失问题。

Invent柱式法（Cat#SD-001）、RIPA裂解液提取小鼠脾脏、肝脏总蛋白的比较

Lane 1-Invent柱式法提取蛋白，Lane 2-RIPA裂解液提取蛋白，Lane 3-Invent柱式法提取RIPA不可溶性组分蛋白；考马斯染色结果显示，使用RIPA裂解液提取蛋白，有很多蛋白丢失在RIPA不可溶的组分中（Lane 3），特别是<20kDa的蛋白质，RIPA的提取物中几乎不含有（Lane 2），且不同样品在低分子量蛋白上均有明显丢失，说明RIPA裂解液对低分子量蛋白提取效果不佳。


为了进一步证实样品质量对低分子量蛋白检出的影响，我们进行了WB验证。

分别使用RIPA裂解液和Invent柱式法提取心肌组织总蛋白，梯度上样30ug、60ug、90ug，检测结果显示，低分子量蛋白Histone H3（~17kDa）检出有明显差异。



使用同种样品提取总蛋白后，等量上样进行WB比较，结果显示Invent柱式法总蛋白提取对于LC3（~14kDa）提取效率更高，更易检出。

以上两个案例均证明柱式法蛋白提取技术可以更有效地提取低分子量蛋白。




02
选择Tricine-SDS-PAGE作为电泳缓冲体系

常规WB采用Glycine-SDS-PAGE缓冲体系分离蛋白，但对于低分子量蛋白可以考虑使用Tricine-SDS-PAGE缓冲体系，Tricine-SDS-PAGE是用来分离 <30kDa蛋白质的首选电泳系统。

Tricine-SDS-PAGE(A)和Glycine-SDS-PAGE(B)分离肌红蛋白片段的比较

丙烯酰胺混合物总浓度（T）和丙烯酰胺浓度（C）相同的Tris-Tricine和Tris-Glycine凝胶对肌红蛋白片段的分离效果，可以看出Tricine-SDS-PAGE对<30kDa的蛋白具有良好的区分度。


（1）Tricine-SDS-PAGE电泳缓冲液、凝胶的配制

低分子量蛋白转移到惰性膜上，选择Tricine-SDS-PAGE和低浓度丙烯酰胺的胶——低浓度的丙烯酰胺有助于蛋白质在膜上的吸附和从凝胶中回收蛋白质；Tricine-SDS-PAGE在缓冲体系中使用较低 pH 值，并用 Tricine 代替Glycine，从而使低分子量蛋白与SDS的离子很好地分离，增加了低分子量蛋白质的区分度。

详细的参考资料以及Tricine-SDS-PAGE缓冲体系电泳缓冲液及凝胶配方点击这里索要！


不同浓度的 Tricine-SDS-PAGE 对蛋白的分辨率也不同
10%T-3%C的凝胶分离范围为1-100 kDa(a)，16%T-3%C凝胶分离范围为1-70kDa(b)，16%T-6%(c)，在凝胶加入双倍的丙烯酰胺和或6 M 尿素[16%T-6%C (c)+6M urea(d)]甚至可以分离1.5 kDa 的蛋白质。

（2）Tricine-SDS-PAGE电泳条件
通常以30V的初始电压开始电泳，保持电压直至样品完全进入浓缩胶中，然后切换下一个适当的电压，注意温度不能超过35~40℃。

注：电泳运行的具体设置在取决于实际所使用设备及其冷却能力、凝胶的长度和厚度以及凝胶的丙烯酰胺浓度。



03
其他注意事项

（1）转印膜的选择：PVDF膜是低分子量蛋白质的较好选择，选择0.22um膜更适用于<20kDa的蛋白质；

（2）建议采用半干式转膜系统，转膜时电压设置为15V，将电流限制为每平方厘米凝胶面积0.4mA 并在室温下进行16-24h。

（3）建议在转膜后，使用丽春红染液染膜（Invent Cat#WA-004）检测转膜效率，蛋白条带分布和上样量如何，如染色后无条带，则需考虑样品问题及转膜问题，进行调整。


综上所述，为了提高低分子量蛋白WB的检出率，首要考虑的是提高样品制备过程中低分子量蛋白的提取率，其次再考虑优化WB实验条件。



参考文献：

[1]Sanchez,Carmen.Fungal potentail for the degradation of petroleum-based polymers: An overview of macro- and microplastics biodegradation. Biotechnology Advances(2019), dio.org/10.1016/j.biotechadv.2019.107501

[2]Schägger, H. Tricine–SDS-PAGE. Nat Protoc 1, 16–22 (2006). https://doi.org/10.1038/nprot.2006.4




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