组会上聊起亚细胞组分分离后（细胞核、细胞膜，细胞器蛋白的WB验证，总会绕到一个经典问题：总蛋白对照，到底要不要跑？
👧一种观点很坚决：必须跑。不跑总蛋白，怎么判断目标是真富集了，还是分离组分里本来就该有？怎么排除交叉污染？怎么证明抗体和WB流程没翻车？
👦另一种观点也很常见：内参跑好就行了，总蛋白对照无非是多一管泳道，定量最后还是靠GAPDH、Actin归一化，跑不跑差别不大。
👱还有第三种声音：跑是跑了，但就是走个形式——收一管RIPA上清，BCA定个量，和分离组分并排上样，至于这管“总蛋白”到底代不代表总蛋白，没细想过。
在亚细胞分离后的WB验证里，总蛋白对照至少承担三重作用，缺了它，结论很难闭环。
分离的目的是获得比原始样本更纯、更富集的目标组分。要证明“富集”，就必须有一个比较起点。只有把分离组分和总蛋白对照放在同一张膜上对比，才能判断目标组分内参蛋白的信号是否真的强于总蛋白。没有这个基线，分离组分里一条看似清晰的条带，可能只说明这个蛋白本来丰度就高，分离并没成功。
总蛋白里必然含有你要检测的所有亚细胞标志物。如果连总蛋白对照孔都检不出预期条带，那分离组分里的“无信号”就没有解释力——它首先说明抗体失效或WB失败，而不是分离失败。只有总蛋白孔条带清晰，后续对分离组分的判读才有价值。
比较不同处理条件下目标蛋白在特定组分中的变化时，总蛋白提供了一种额外的归一化基准，可以部分校正分离操作带来的回收率波动。
所以，总蛋白对照不是可做可不做的“形式主义”。而是判断富集，流程阳性对照，归一化这三个功能的必要条件。
绝大多数实验室的默认操作是：收一份细胞，RIPA裂解，离心，取上清，BCA定量，这管上清就被当成了“总蛋白”。
这个操作太顺手了，顺手到很少有人停下来问一句：
RIPA裂解液本质上是一种选择性增溶缓冲液。它的去污剂组合能有效溶解胞质蛋白和多数核蛋白，但对膜蛋白、多次跨膜蛋白、核基质蛋白、组蛋白和DNA结合蛋白、细胞骨架蛋白以及部分疏水性强的信号分子，溶解能力相当有限。裂解离心后，这些蛋白有相当比例留在了不可溶沉淀里，而你只取了上清。
图片来源：Kevin A. Janes，2017，Sci Signal. ; 8(371): rs2. doi:10.1126/scisignal.2005966.
文献数据表明：RIPA可溶组分只覆盖细胞蛋白谱的一部分，10–30%的蛋白会丢失在不可溶组分中，而且丢失是不成比例的。Tubulin、lamin A、KRT5在RIPA不可溶组分中大量存在；EGFR、HSP90、c-Src、β-catenin也能在沉淀里被WB检到。有研究直接指出，lamin蛋白在RIPA体系中的浓度可能被低估20–30%。更极端的情况是，某些蛋白几乎只存在于RIPA不可溶组分中——用RIPA上清作对照，信号本身就是缺失的。
换句话说，你手里的那管“总蛋白”，本质上是 “RIPA可溶性蛋白” ，不是一个能公平代表细胞真实蛋白总量的基准。
亚细胞分离WB验证的核心比较是：分离组分中的目标蛋白信号 vs. 总蛋白中的信号。
如果目标蛋白恰好是一个膜蛋白或难溶蛋白，它在RIPA“总蛋白”对照孔里的信号被人为压低了。而分离组分往往使用了不同的裂解条件，或者本身就是富集在低背景组分中，目标蛋白被相对完整地回收。两条泳道放在一起，“富集倍数”被系统性高估。
你看到的是“分离成功，目标蛋白显著富集”；实际发生的可能只是“RIPA对照孔里这个蛋白本来就被丢掉了”。反过来，如果你在分离组分中看到某个“不应该出现”的标志蛋白信号，用一管有偏倚的总蛋白去判断污染与否，结论同样不可靠——因为这个基线就不准。
这不是操作上的小瑕疵，而是一个有方向性的系统偏倚。越是疏水、越难溶、越是你的课题真正关心的那类蛋白，这个偏倚越大。
判断标准其实很朴素：对照的溶解能力，必须能覆盖你要检测的目标蛋白。
如果目标蛋白是胞质可溶性蛋白，RIPA上清大体够用。但只要涉及膜蛋白、核基质蛋白、细胞骨架蛋白或疏水性强的信号分子，就需要一个没有难溶蛋白损失的总蛋白参照。可选路径包括：用含SDS或尿素的强增溶体系制备对照；保留RIPA沉淀、用SDS上样缓冲液煮沸溶解后与上清合并；或者直接采用不产生不可溶沉淀的提取方案，从源头上避免“总蛋白不总”的问题。
Invent的Minute™柱式法蛋白提取试剂盒，设计逻辑就是绕开“裂解—离心—取上清—丢沉淀”这条会造成蛋白丢失的路径。细胞通过特制的裂解液高效裂解，通过离心管柱处理，不产生需要丢弃的不可溶沉淀组分，蛋白谱的完整性因此得以保留。
Invent柱式法不改变样本内源性基线，避免RIPA法造成的蛋白非等比例丢失，获得的蛋白图谱更完整，处理时间低至1分钟。且支持从总蛋白到质膜、细胞核、线粒体、内质网、高尔基体、脂筏、溶酶体等多种亚细胞组分的配套分离——总蛋白对照和分离组分可以在同一技术平台上制备，溶解行为更一致，比较的公平性也更高。对亚细胞分离后的WB验证来说，这意味着你的“总蛋白对照”不再是一个只含可溶蛋白的偏倚样本。
一项对比研究曾用柱式法商业试剂盒与RIPA可溶/不可溶组分的蛋白图谱做平行比较，结论是：RIPA不可溶组分的丢失覆盖了整个分子量范围，且不同样本的丢失情况不可预测；而柱式法不产生不可溶组分，图谱更完整，产量更高。
图片来源：Li,Q. (2016).Pitfalls of Protein Extraction by RIPA Buffer. Biotechniques. 61:327.
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