膜蛋白在分子转运、信号转导、能量利用以及细胞和组织结构的维护等基础生理过程中具有极其重要的作用。不同类型的膜蛋白行使着各自的功能，保证了生物体正常发育生长。大约60%的药物作用靶点是膜蛋白。故膜蛋白研究的意义重大，而膜蛋白研究面临的困难之一就是如何有效分离膜蛋白。

Invent精心打造的柱式法膜蛋白分离“宝藏级”工具（Cat#SM-005）可助您花式搞定膜蛋白研究！


NO.01
蛋白定性定位转运研究（WB）


膜蛋白定性研究
通常膜蛋白表达丰度较低，蛋白定性检测时较为困难，分离富集膜蛋白后再进行检测，可大幅度降低检测难度。如下案例：



图片来源：doi:10.1371/journal.pone.0130605

Kashiwagi Y等人[1]研究缺血再灌注对SGLT1跨膜蛋白表达水平有无影响时，使用离心管柱法对灌注后小鼠心脏样品进行组分分离，分别使用总膜（细胞器膜+质膜）（图A）和质膜部分（图C）进行WB检测，与总膜部分相比，富集质膜蛋白组分后检测SGLT1和膜蛋白内参Na+/K+ ATPase信号都有显著的增强，降低检测难度的同时获取了更加准确的结果。


膜蛋白定位研究

蛋白质的功能与其亚细胞位置有着密切的联系，对于确定一个未知特性蛋白质的功能，亚细胞定位研究能够提供重要的参考信息。将细胞组分分离后，对不同组分分别检测，即可判断目标蛋白的亚细胞定位。如下案例：


图片来源：doi.org/10.1038/s41422-019-0184-1

Yan Zhang等人[2]使用离心管柱法将293T细胞分为细胞浆和细胞膜组分，分别使用Tubulin和Na+/K+ATPase作为胞浆和细胞膜内参，验证组分分离干净，无交叉污染。检测目标蛋白CTLA-4只存在于细胞膜组分中而不存在于细胞浆中，明确了其亚细胞定位。


膜蛋白转运研究
当研究目标蛋白是否在某些条件下或某种处理之后，会发生蛋白转运改变，可进行细胞组分分离，分别使用不同组分进行目标蛋白的检测，可以追踪蛋白转运过程的每一个环节，让文章的故事情节更完整。如下案例：


图片来源：doi:org/ 10.4049/jimmunol.1400817

Leung等人[3]研究PRL3对ULBP2蛋白转运的影响。人结肠癌细胞系HCT116使用40uM PRL3-I处理，使用离心管柱法进行细胞组分分离，分别对细胞质膜，细胞器和细胞浆组分进行WB检测，结果显示，经过PRL3-I处理后抑制了ULBP2的成熟，导致ULBP2蛋白在内质网中的滞留，而无法转运到细胞质膜上。


NO.02
蛋白互作研究（IP，CO-IP）
蛋白质是生物功能最直接的执行者，虽然一些蛋白质可以独立的完成使命，但是大部分蛋白都需要一些伴侣分子的协助一起完成任务或者形成复合物之后才能充分发挥他的功能。所以，了解蛋白质与蛋白质之间的相互作用，能够帮助我们更好的了解细胞的生命活性，揭示隐藏在表象下的调控机理。IP和CO-IP实验是证明细胞内蛋白间的相互作用经典方法。为证实膜上蛋白与其他蛋白的互作，可以选择分离膜蛋白后，进行IP和Co-IP实验。如下案例：

IP（免疫沉淀）


图片来源：doi.org/10.1016/j.gendis.2019.12.010

Zhong W等人[4]为了阐明R945X变异的致病性，进行了生化实验，以确定蛋白质功能是否受到影响。将FLAG-PTCH1 WT和R945X两个质粒转染HEK-293FT细胞，提取质膜蛋白，WB检测野生型PTCH1与R945X突变体的蛋白表达无明显差异。然后进行免疫沉淀分析和免疫印迹分析。与野生型蛋白相比，R945X突变体在免疫沉淀试验中显示出约低75%的相对丰度(p <0.001)，意味着R945X突变体体外稳定性下降。


CO-IP（免疫共沉淀）


图片来源：10.3389/fnagi.2022.896522

Yunjie Qiu等人[5]研究ADAMTS1对遗传和获得性因素与淀粉样前体蛋白（APP）代谢的联系时，将转染APP和ATS1的HEK 293T细胞进行细胞组分分离，然后使用Myc tag (APP)抗体共免疫共沉淀。Western blot结果显示，ATS1与APP的相互作用主要发生在质膜(Na+/K+ ATPase)。


NO.03
蛋白质组学研究

蛋白质组学（proteomics）是系统研究某一基因组所表达的所有蛋白质，包括组成蛋白质一级结构的氨基酸序列，蛋白质的丰度，蛋白质的修饰以及蛋白质之间的相互作用。其中差异蛋白质组学，可通过寻找各种因素引起的蛋白质表达差异，以解释细胞生理和病理机制。如想研究膜蛋白的表达差异，可选择分离膜蛋白后进行蛋白质组学分析。如下案例：



图片来源：doi.org/10.1021/acs.jproteome.0c00358

Dan Shen等人[6]通过质谱技术的研究了荷斯坦公牛X和Y精子中总膜蛋白的差异表达，该研究分别获取荷斯坦公牛X和Y精子总膜组分，然后进行蛋白质质谱分析，一共鉴定出1521种蛋白质，在X和Y精子组中，分别特异性表达了151种和88种蛋白质。通过跨膜结构预测、亚细胞定位和蛋白质印迹验证结果发现 CLRN3和SCAMP1蛋白分别是X和Y精子的细胞表面特异性抗原，此研究结果将有助于分选特定的精液以控制牲畜性别。


NO.04
脂质组学研究

质膜不是一个统一的结构，而是由不同的区域组成，每个区域具有不同的脂质，结构和信号活性，并可以通过特定的脂质-脂质，脂质-蛋白相互作用动态调整。肿瘤细胞最显著的特征之一是脂质代谢的改变，因此造成细胞膜成分异常。在转化细胞中，细胞膜的大量脂质种类被重新编辑，以改变细胞膜的物理特性，并创造一种促肿瘤细胞状态。所以细胞膜的脂质组学研究尤为重要，可将细胞膜分离后进行脂质分离，再进行脂质组学分析。如以下案例：



Heatmap of PM lipid changes in T-cells of ORP4L KI and littermate wild-typemice

图片来源：doi.org/10.1038/s41467-022-32104-7

Wenbin Zhong等人[7]报道了羟甾醇结合蛋白(OSBP)相关蛋白4L (ORP4L)在成年T细胞白血病(ATL)细胞中表达，而在正常T细胞中不表达。将ORP4L敲入T细胞中，ORP4L与OSBP形成二聚体以控制OSBP作为磷脂酰肌醇4-磷酸[PI(4)P]/胆固醇的交换剂在高尔基体和质膜(PM)之间穿梭。发现高尔基体和质膜之间存在一种非泡状脂质运输机制，维持了致癌信号的能力，启动了T细胞的恶化和白血病的发生。


NO.05
纳米材料表面修饰

细胞膜作为生物体内环境交流的窗口和界面，一直被不断模拟并用于纳米颗粒的包裹与伪装，借以改善纳米颗粒的生物学特征。获取具有活性的细胞膜膜片后，对纳米材料进行修饰，可使纳米材料逃避免疫系统的清除，并可增强其靶向作用。如下案例：

MP-Au/ZnO@CCM形态


Morphology and composition characterizations of the MP-Au/ZnO@CCM.
negatively stained C6 cell membrane vesicles(图左)

动态光散射测量的 AuNPs 和 CCM 囊泡的尺寸分布


a) Size distribution ofAuNPs and CCM vesicles measured by dynamic light scattering.
图片来源：DOI:10.1016/j.nanoen.2021.106208.

Kongshuo Ma等人[8]通过在Au/ZnO纳米组件上修饰聚乙二醇（PEG）和线粒体靶向肽（MLS），然后使用C6癌细胞细胞膜(CCM)包裹纳米材料，最终成功构建了一种新型的Au/ZnO肿瘤治疗平台(MP-Au/ZnO@CCM),MP-Au/ZnO@CCM 纳米发电机在超声激发下以多种方式实现靶向电刺激和加强肿瘤催化治疗。


以上五类应用案例全部使用了Invent MinuteTM 柱式法质膜和细胞组分分离工具（Cat#SM-005）进行细胞膜或细胞膜蛋白和细胞组分的分离。

Minute ™质膜蛋白和细胞组分分离试剂盒

SM-005

（1）小起始样品量：仅需20-30mg组织样品或2-5*107个细胞；

（2）无需自配溶液，无需Dounce匀浆和超高速离心步骤，省时高效，大约1小时即可完成分离；

（3）可将细胞同时分为细胞核，细胞浆，细胞器，细胞膜组分，组分间交叉污染低；可获得具有天然活性的细胞膜结构。

（4）适用于多种下游应用，如蛋白定性定量转运实验，蛋白互作研究、蛋白质组学、脂质组学、纳米材料表面修饰等。



这样“宝藏级”膜蛋白分离工具，可同时满足五类下游应用，是不可多得的膜蛋白研究利器！快来咨询我们吧！


参考文献：

[1]Kashiwagi Y,Nagoshi T,Yoshino T,et al.Expression of SGLT1 in Human Hearts and Impairment of Cardiac Glucose Uptake by Phlorizin during Ischemia- Reperfusion Injury in Mice. PLoS ONE 10(6):e0130605(2015). 

[2]Hijacking antibody-induced CTLA-4 lysosomal degradation for safer and more effective cancer immunotherapy. Cell research, 1.

[3]Leung W-H,et al.PRL-3 Mediates the protein Maturation of ULBP2 by regulating the tyrosine phosphorylation of HSP60.The Journal of Immunology(2015).

[4]Zhong, W., Zhao, H., Huang, W., Zhang, M., Zhang, Q., Zhang, Y., ... & Maimaitili, G. (2020). Identification of rare PTCH1 nonsense variant causing orofacial cleft in a Chinese family and an up-to-date genotype-phenotype analysis. Genes & Diseases.

[5]Qiu, Y., Sha, L., Zhang, X., Li, G., Zhu, W., & Xu, Q. (2022). Induction of A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs 1 by a rare variant or cognitive activities reduces hippocampal amyloid-β and consequent Alzheimer’s disease risk. Frontiers in Aging Neuroscience, 14, 896522.

[6]D Shen, C Zhou, M Cao, W Cai, H Yin. (2021). Differential Membrane Protein Profile in Bovine X- and Y‑Sperm.Journal of Proteome Research .

[7]Zhong, W., Lin, W., Yang, Y., Chen, D., Cao, X., Xu, M., ... & Yan, D. (2022). An acquired phosphatidylinositol 4-phosphate transport initiates T-cell deterioration and leukemogenesis. Nature Communications, 13(1), 1-18.

[8]Ma, K., Qi, G., Wang, B., Yu, T., Zhang, Y., Li, H., ... & Jin, Y. (2021). Ultrasound-activated Au/ZnO-based Trojan nanogenerators for combined targeted electro-stimulation and enhanced catalytic therapy of tumor. Nano Energy, 106208.